Jak powstaje pożywka do uprawy kultur in vitro roślin – proces i składniki

Pożywka do kultur in vitro powstaje przez precyzyjne odmierzenie składników mineralnych, węglowodanów, witamin i regulatorów wzrostu, rozpuszczenie ich w sterylnej wodzie, ustawienie pH na około 5,8 oraz sterylizację w autoklawie. Kluczowe są czystość surowców, zgodność receptury (np. Murashige & Skoog) i dopasowanie hormonów do celu hodowli (ukorzenianie, namnażanie pędów, kalus). Poniżej znajdziesz kompletny, praktyczny opis procesu i roli poszczególnych składników.

Z czego składa się kompletna pożywka dla kultur in vitro roślin

Podstawą jest zestaw związków mineralnych. Makro- i mikroelementy dostarczają roślinie azotu, fosforu, potasu, wapnia, magnezu, siarki oraz pierwiastków śladowych jak żelazo, mangan, cynk, miedź, bor i molibden. Standardem odniesienia pozostaje pożywka MS (Murashige & Skoog), ceniona za wysoką zawartość azotu i szerokie zastosowanie w namnażaniu pędów i kalusa.

Drugim filarem są węglowodany będące zewnętrznym źródłem energii, bo eksplantaty początkowo nie prowadzą efektywnej fotosyntezy. Najczęściej stosuje się sacharozę (20–30 g/L), rzadziej glukozę. Cukry stabilizują ciśnienie osmotyczne i wspierają regenerację tkanek.

Witaminy – głównie z grupy B (tiamina B1, pirydoksyna B6, niacyna) – uzupełniają szlaki metaboliczne, przyspieszając podziały i różnicowanie. W wielu recepturach pojawia się też mio-inozytol, poprawiający żywotność kultur.

Hormony wzrostu (regulatory) sterują morfogenezą: auksyny (np. IAA, IBA, NAA) inicjują korzenie i kalus, cytokininy (BA/BAP, kinetyna) pobudzają pąki i pędy, a gibereliny (GA3) wydłużają pędy i przełamują spoczynki. Ich proporcje decydują o tym, czy tkanka wytworzy korzeń, pęd czy tkankę kalusową.

Jako dodatki stosuje się czasem aminokwasy (np. glicyna, kwas glutaminowy) w niewielkich stężeniach, by dostarczyć łatwo przyswajalnego azotu i wspomóc reaktywację metabolizmu wrażliwych eksplantatów.

Jak krok po kroku przygotować pożywkę – proces technologiczny

Zacznij od dobrania receptury do celu hodowli. Do masowego namnażania pędów wybierz modyfikowaną MS z przewagą cytokininy; do ukorzeniania – mniejszą dawkę soli mineralnych i umiarkowaną auksynę (np. IBA). W praktyce laboratoria opracowują 2–3 konfiguracje robocze i rotują je w zależności od fazy kultury.

Odmierz proszek soli mineralnych (gotowe zestawy MS upraszczają pracę), dodaj witaminy i ewentualne aminokwasy. Rozpuść w wodzie destylowanej i autoklawowanej, zachowując kolejność: sole mineralne, witaminy, cukier. Węglowodany dodawaj po pełnym rozpuszczeniu soli – ogranicza to karmelizację i precypitację.

Ustaw pH pożywki na 5,8 (±0,1) przy użyciu NaOH lub HCl o niskim stężeniu. Ten zakres zapewnia optymalną biodostępność mikroelementów oraz stabilność większości regulatorów. Pamiętaj, że po dodaniu agaru pH może się nieznacznie zmienić.

Dodaj środek żelujący (najczęściej agar 6–8 g/L). W przypadku kultur płynnych pomiń zagęszczacz. Rozlej pożywkę do kolb lub słoików, zabezpiecz korkami/paroprzepuszczalnymi nakrętkami.

Przeprowadź sterylizację w autoklawie (zwykle 121°C, 15–20 min). Wrażliwe składniki, jak niektóre hormony wzrostu, dodawaj po ostudzeniu (ok. 45–50°C), sterylnie, przez filtrację membranową 0,22 μm i z użyciem komory laminarnej.

Po przygotowaniu oznacz partię (data, receptura, stężenia regulatorów). Wykonaj kontrolę jałowości – inkubuj próbkę bez eksplantatu przez 3–5 dni, obserwując ewentualne zmętnienie lub naloty. Dopiero po czystym teście zatowaruj linię hodowlaną.

Rola poszczególnych regulatorów i praktyczne proporcje

W kulturach inicjacyjnych przewaga auksyny nad cytokiną sprzyja tworzeniu kalusa i korzeni (np. 0,5–1,0 mg/L IBA + 0,1–0,2 mg/L BA). W fazie namnażania pędów odwróć proporcje (np. 1,0–2,0 mg/L BA + śladowa auksyna 0,05–0,1 mg/L NAA). Giberelina (GA3 0,1–0,5 mg/L) bywa dodawana krótkoterminowo do wydłużenia pędów, ale jej nadmiar może obniżać jakość in vitro (kruchość tkanek).

Nie wszystkie gatunki reagują identycznie. Rośliny drzewiaste częściej wymagają wyższych stężeń cytokininy i dodatków organicznych, podczas gdy zboża bywają wrażliwe na nadmiar soli amonowych. Dlatego po recepturze bazowej MS warto wprowadzać drobne modyfikacje i testy A/B na małych partiach eksplantatów.

Jakość wody, pH i sterylność – krytyczne parametry procesu

Używaj wyłącznie wody o wysokiej czystości: destylowanej, dejonizowanej, a następnie autoklawowanej. Śladowe ilości jonów metali ciężkich lub zanieczyszczeń organicznych potrafią hamować wzrost kalusa i inicjację pąków.

Utrzymanie pH ≈ 5,8 stabilizuje strukturę ściany komórkowej i biodostępność żelaza, manganu oraz fosforu. Zbyt niskie pH zwiększa rozpuszczalność metali do poziomów toksycznych; zbyt wysokie ogranicza pobieranie mikroelementów i spowalnia mitozę.

Sterylność determinują czyste szkło, filtry paroprzepuszczalne i właściwa technika pracy w laminarze. Nawet krótki kontakt pożywki z niefiltrowanym powietrzem skutkuje kontaminacją grzybową. Dla partii krytycznych stosuj testy bioburden oraz zapis cykli autoklawowania.

Eksplantaty i dopasowanie pożywki do etapu kultury

Eksplantaty (liście, merystemy, fragmenty pędów) przygotuj przez mycie, dezynfekcję powierzchniową i szybkie przeniesienie na świeżą pożywkę. W początkowej fazie wybierz recepturę o wyższej zawartości cukru i delikatnych regulatorach, ograniczając stres osmotyczny i oksydacyjny.

Po ukorzenieniu stopniowo redukuj cytokininy i cukry, by zachęcić roślinę do samodzielnej fotosyntezy. Przed aklimatyzacją do warunków ex vitro obniż stężenie auksyn, a gęstość agaru dostosuj tak, by korzenie miały dobry kontakt z pożywką, ale nie dochodziło do hipoksji.

Gotowe mieszanki i praktyczne ułatwienia dla laboratoriów

Aby skrócić czas przygotowania i ograniczyć zmienność między partiami, laboratoria często sięgają po gotowe zestawy soli i witamin w formie proszku. To redukuje ryzyko błędów ważenia i ułatwia standaryzację. Jeśli potrzebujesz ułożonego łańcucha dostaw, sprawdź Mieszanina do przygotowania pożywki dla kultur in vitro roślin – rozwiązanie wygodne dla zespołów B2B, które rozliczają wiele serii w miesiącu.

• Do partii eksperymentalnych filtruj roztwory regulatorów (0,22 μm) i dodawaj je tuż przed rozlewem – zwiększa to powtarzalność efektów.
• Wprowadzaj zmiany jednego parametru naraz (np. BA z 0,5 do 1,0 mg/L); szybciej wyłapiesz rzeczywiste zależności dawka–reakcja.

Najczęstsze problemy i szybkie diagnozy w kulturach in vitro

Zbrązowienie tkanek i zahamowanie wzrostu zwykle wskazuje na nadmiar fenoli – pomóż sobie dodatkiem węgla aktywnego lub skróć czas do pierwszego pasażowania. Szklistość pędów najczęściej wynika z nadmiernej cytokininy albo zbyt wysokiej wilgotności w naczyniu.

Brak korzeni przy obfitym rozroście pędów sugeruje niedobór auksyny lub zbyt wysoką siłę jonową pożywki. Wolne podziały komórkowe mogą świadczyć o zbyt niskiej podaży cukrów albo odchyleniu pH od 5,8. Kontroluj też światło: nawet niewielka zmiana fotoperiodu wpływa na morfogenezę.